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    細胞破碎

    日期:2024-04-22 17:14
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    摘要:

         細胞破碎(cellrupture)技術是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁,使細胞內容物包括目的產物成分釋放出來的技術。細胞破碎技術是分離純化細胞內合成的非分泌型生化物質(產品)的基礎。隨著重組DNA技術和組織培養技術上的重大進展,以前認為很難獲得的蛋白質現在可以大規模生產。

    一、細胞破碎阻力

          細菌

         幾乎所有細菌的細胞壁都是由肽聚糖(peptidoglycan)組成,它是難溶性的聚糖鏈(glycanchain),借助短肽交聯而成的網狀結構,包圍在細胞周圍,使細胞具有一定的形狀和強度。短肽一般由四或五個氨基酸組成,如L-丙氨酰-D-谷氨酰-L-賴氨酰-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-氨基酸與二氨基庚二酸存在。破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網狀結構,其網結構的致密程度和強度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數量和其交聯的程度,如果交聯程度大,則網結構就致密。大腸桿菌(E.coli)屬于細菌。

           酵母菌
          酵母細胞壁的最里層是由葡聚糖的細纖維組成,它構成了細胞壁的剛性骨架,使細胞具有一定的形狀,覆蓋在細纖維上面的是一層糖蛋白,最外層是甘露聚糖,由1,6一磷酸二酯鍵共價連接,形成網狀結構。在該層的內部,有甘露聚糖-酶的復合物,它可以共價連接到網狀結構上,也可以不連接。與細菌細胞壁一樣,破碎酵母細胞壁的阻力主要決定于壁結構交聯的緊密程度和它的厚度。 

           真菌
         霉菌的細胞壁主要存在三種聚合物,葡聚糖(主要以β-1,3糖苷鍵連接,某些以β-1,6糖苷鍵連接),幾丁質(以微纖維狀態存在)以及糖蛋白。最外層是α-和β-葡聚糖的混合物,第2層是糖蛋白的網狀結構,葡聚糖與糖蛋白結合起來,第3層主要是蛋白質,最內層主要是幾丁質,幾丁質的微纖維嵌入蛋白質結構中。與酵母和細菌的細胞壁一樣,真菌細胞壁的強度和聚合物的網狀結構有關,不僅如此,它還含有幾丁質或纖維素的纖維狀結構,所以強度有所提高。
     
          植物細胞
          對于已生長結束的植物細胞壁可分為初生壁和次生壁兩部分。初生壁是細胞生長期形成的。次生壁是細胞停止生長后,在初生壁內部形成的結構。目前,較流行的初生細胞壁結構是由Lampert等人提出的“經緯”模型,依據這一模型,纖維素的微纖絲以平行于細胞壁平面的方向一層一層敷著在上面,同一層次上的微纖絲平行排列,而不同層次上則排列方向不同,互成一定角度,形成獨立的網絡,構成了細胞壁的“經”,模型中的“緯”是結構蛋白(富含羥脯氨酸的蛋白),它由細胞質分泌,垂直于細胞壁平面排列,并由異二酪氨酸交聯成結構蛋白網,徑向的微纖絲網和緯向的結構蛋白網之間又相互交聯,構成更復雜的網絡系統。半纖維素和果膠等膠體則填充在網絡之中,從而使整個細胞壁既具有剛性又具有彈性。在次生壁中,纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多,纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規則,而且存在木質素(酚類組分的聚合物)的沉積。因此次生壁的形成提高了細胞壁的堅硬性,使植物細胞具有很高的機械強度。
     
    二、細胞破碎技術

          目前世界上有多種細胞破碎方法,以適應不同用途和不同類型的細胞壁破碎。破碎方法可規納為機械法和非機械法兩大類。在此重點介紹機械法中的高壓均質破碎法。

          高壓均質破碎法(homogenization):在歐美、中國、日本、韓國等多個國家,高壓均質機是常用的細胞破碎設備。美國PhD高壓均質機,其結構由電機驅動泵體,進而在均質閥體內生成壓力。細胞漿液通過止回閥進入均質閥體內,在高壓下迫使其在均質閥的小孔中高速沖出,且由于瞬間減壓和高速沖擊,使細胞同時受到高的液相剪切效用、空穴效用、撞擊效用而破碎。在操作方式上,可以采用單次通過高壓均質機或多次循環通過等方式,也可連續操作。為了控制溫度的升高,PhD同時采用內置式冷卻和外部冷卻的方式,使出料最低溫度能控制在0-10℃左右。在工業規模的細胞破碎中,對于大腸桿菌,用美國PhD高壓均質機,在15,000psi(1,035bar),均質一次即可達用用戶要求;對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細胞,常采用均質壓力在25,000psi(1,720bar)的情況下均質。


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